ಐಪಿಟಿಜಿ (ಐಸೊಪ್ರೊಪಿಲ್-β-ಡಿ-ಥಿಯೋಗಲ್ಯಾಕ್ಟೋಸೈಡ್) β-ಗ್ಯಾಲಕ್ಟೋಸಿಡೇಸ್ ತಲಾಧಾರದ ಅನಲಾಗ್ ಆಗಿದೆ, ಇದು ಹೆಚ್ಚು ಪ್ರೇರಿತವಾಗಿದೆ. ಐಪಿಟಿಜಿಯ ಪ್ರಚೋದನೆಯ ಅಡಿಯಲ್ಲಿ, ಪ್ರೇರಕವು ರೆಪ್ರೆಸರ್ ಪ್ರೋಟೀನ್ನೊಂದಿಗೆ ಸಂಕೀರ್ಣವನ್ನು ರೂಪಿಸಬಹುದು, ಇದರಿಂದಾಗಿ ರೆಪ್ರೆಸರ್ ಪ್ರೋಟೀನ್ನ ರಚನೆಯು ಬದಲಾಗುತ್ತದೆ, ಇದರಿಂದಾಗಿ ಅದನ್ನು ಗುರಿ ಜೀನ್ನೊಂದಿಗೆ ಸಂಯೋಜಿಸಲಾಗುವುದಿಲ್ಲ ಮತ್ತು ಗುರಿ ಜೀನ್ ಅನ್ನು ಪರಿಣಾಮಕಾರಿಯಾಗಿ ವ್ಯಕ್ತಪಡಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ. ಹಾಗಾದರೆ ಪ್ರಯೋಗದ ಸಮಯದಲ್ಲಿ ಐಪಿಟಿಜಿಯ ಸಾಂದ್ರತೆಯನ್ನು ಹೇಗೆ ನಿರ್ಧರಿಸಬೇಕು? ದೊಡ್ಡದಿದ್ದಷ್ಟೂ ಉತ್ತಮವೇ?
ಮೊದಲಿಗೆ, IPTG ಪ್ರಚೋದನೆಯ ತತ್ವವನ್ನು ಅರ್ಥಮಾಡಿಕೊಳ್ಳೋಣ: E. coli ಯ ಲ್ಯಾಕ್ಟೋಸ್ ಒಪೆರಾನ್ (ಅಂಶ) ಮೂರು ರಚನಾತ್ಮಕ ಜೀನ್ಗಳನ್ನು ಒಳಗೊಂಡಿದೆ, Z,Y, ಮತ್ತು A, ಇವು ಕ್ರಮವಾಗಿ β-ಗ್ಯಾಲಕ್ಟೋಸಿಡೇಸ್, ಪರ್ಮೀಸ್ ಮತ್ತು ಅಸಿಟೈಲ್ಟ್ರಾನ್ಸ್ಫರೇಸ್ ಅನ್ನು ಎನ್ಕೋಡ್ ಮಾಡುತ್ತವೆ. lacZ ಲ್ಯಾಕ್ಟೋಸ್ ಅನ್ನು ಗ್ಲೂಕೋಸ್ ಮತ್ತು ಗ್ಯಾಲಕ್ಟೋಸ್ ಅಥವಾ ಅಲೋ-ಲ್ಯಾಕ್ಟೋಸ್ ಆಗಿ ಹೈಡ್ರೋಲೈಸ್ ಮಾಡುತ್ತದೆ; lacY ಪರಿಸರದಲ್ಲಿ ಲ್ಯಾಕ್ಟೋಸ್ ಜೀವಕೋಶ ಪೊರೆಯ ಮೂಲಕ ಹಾದುಹೋಗಲು ಮತ್ತು ಕೋಶವನ್ನು ಪ್ರವೇಶಿಸಲು ಅನುವು ಮಾಡಿಕೊಡುತ್ತದೆ; lacA ಅಸಿಟೈಲ್ ಗುಂಪನ್ನು ಅಸಿಟೈಲ್-CoA ಯಿಂದ β-ಗ್ಯಾಲಕ್ಟೋಸೈಡ್ಗೆ ವರ್ಗಾಯಿಸುತ್ತದೆ, ಇದು ವಿಷಕಾರಿ ಪರಿಣಾಮವನ್ನು ತೆಗೆದುಹಾಕುವುದನ್ನು ಒಳಗೊಂಡಿರುತ್ತದೆ. ಇದರ ಜೊತೆಗೆ, ಒಂದು ಕಾರ್ಯಾಚರಣಾ ಅನುಕ್ರಮ O, ಆರಂಭಿಕ ಅನುಕ್ರಮ P ಮತ್ತು ನಿಯಂತ್ರಕ ಜೀನ್ I ಇದೆ. I ಜೀನ್ ಕೋಡ್ ಒಂದು ದಮನಕಾರಿ ಪ್ರೋಟೀನ್ ಆಗಿದ್ದು ಅದು ಆಪರೇಟರ್ ಅನುಕ್ರಮದ O ಸ್ಥಾನಕ್ಕೆ ಬಂಧಿಸಬಹುದು, ಇದರಿಂದಾಗಿ ಒಪೆರಾನ್ (ಮೆಟಾ) ನಿಗ್ರಹಿಸಲ್ಪಡುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಆಫ್ ಆಗುತ್ತದೆ. ಇನಿಶಿಯೇಟಿಂಗ್ ಸೀಕ್ವೆನ್ಸ್ P ಯ ಮೇಲ್ಭಾಗದಲ್ಲಿ ಕ್ಯಾಟಬಾಲಿಕ್ ಜೀನ್ ಆಕ್ಟಿವೇಟರ್ ಪ್ರೋಟೀನ್-CAP ಬೈಂಡಿಂಗ್ ಸೈಟ್ಗೆ ಬೈಂಡಿಂಗ್ ಸೈಟ್ ಕೂಡ ಇದೆ. P ಸೀಕ್ವೆನ್ಸ್, O ಸೀಕ್ವೆನ್ಸ್ ಮತ್ತು CAP ಬೈಂಡಿಂಗ್ ಸೈಟ್ ಒಟ್ಟಾಗಿ ಲ್ಯಾಕ್ ಒಪೆರಾನ್ನ ನಿಯಂತ್ರಕ ಪ್ರದೇಶವನ್ನು ರೂಪಿಸುತ್ತವೆ. ಜೀನ್ ಉತ್ಪನ್ನಗಳ ಸಂಘಟಿತ ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿಯನ್ನು ಸಾಧಿಸಲು ಮೂರು ಕಿಣ್ವಗಳ ಕೋಡಿಂಗ್ ಜೀನ್ಗಳನ್ನು ಒಂದೇ ನಿಯಂತ್ರಕ ಪ್ರದೇಶದಿಂದ ನಿಯಂತ್ರಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ.
ಲ್ಯಾಕ್ಟೋಸ್ ಅನುಪಸ್ಥಿತಿಯಲ್ಲಿ, ಲ್ಯಾಕ್ ಒಪೆರಾನ್ (ಮೆಟಾ) ದಮನ ಸ್ಥಿತಿಯಲ್ಲಿರುತ್ತದೆ. ಈ ಸಮಯದಲ್ಲಿ, PI ಪ್ರವರ್ತಕ ಅನುಕ್ರಮದ ನಿಯಂತ್ರಣದಲ್ಲಿ I ಅನುಕ್ರಮದಿಂದ ವ್ಯಕ್ತಪಡಿಸಲಾದ ಲ್ಯಾಕ್ ದಮನಕಾರಿಯು O ಅನುಕ್ರಮಕ್ಕೆ ಬಂಧಿಸುತ್ತದೆ, ಇದು RNA ಪಾಲಿಮರೇಸ್ ಅನ್ನು P ಅನುಕ್ರಮಕ್ಕೆ ಬಂಧಿಸುವುದನ್ನು ತಡೆಯುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಪ್ರತಿಲೇಖನ ಆರಂಭವನ್ನು ಪ್ರತಿಬಂಧಿಸುತ್ತದೆ; ಲ್ಯಾಕ್ಟೋಸ್ ಇದ್ದಾಗ, ಲ್ಯಾಕ್ ಒಪೆರಾನ್ (ಮೆಟಾ) ಅನ್ನು ಪ್ರಚೋದಿಸಬಹುದು ಈ ಒಪೆರಾನ್ (ಮೆಟಾ) ವ್ಯವಸ್ಥೆಯಲ್ಲಿ, ನಿಜವಾದ ಪ್ರಚೋದಕವು ಲ್ಯಾಕ್ಟೋಸ್ ಅಲ್ಲ. ಲ್ಯಾಕ್ಟೋಸ್ ಕೋಶವನ್ನು ಪ್ರವೇಶಿಸುತ್ತದೆ ಮತ್ತು β-ಗ್ಯಾಲಕ್ಟೋಸಿಡೇಸ್ನಿಂದ ವೇಗವರ್ಧಿಸಿ ಅಲೋಲ್ಯಾಕ್ಟೋಸ್ ಆಗಿ ಪರಿವರ್ತನೆಗೊಳ್ಳುತ್ತದೆ. ಎರಡನೆಯದು, ಪ್ರಚೋದಕ ಅಣುವಾಗಿ, ದಮನಕಾರಿ ಪ್ರೋಟೀನ್ಗೆ ಬಂಧಿಸುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಪ್ರೋಟೀನ್ ರೂಪಾಂತರವನ್ನು ಬದಲಾಯಿಸುತ್ತದೆ, ಇದು O ಅನುಕ್ರಮ ಮತ್ತು ಪ್ರತಿಲೇಖನದಿಂದ ದಮನಕಾರಿ ಪ್ರೋಟೀನ್ನ ವಿಘಟನೆಗೆ ಕಾರಣವಾಗುತ್ತದೆ. ಐಸೊಪ್ರೊಪಿಲ್ಥಿಯೋಗಲ್ಯಾಕ್ಟೋಸೈಡ್ (IPTG) ಅಲೋಲ್ಯಾಕ್ಟೋಸ್ನಂತೆಯೇ ಪರಿಣಾಮವನ್ನು ಬೀರುತ್ತದೆ. ಇದು ಅತ್ಯಂತ ಶಕ್ತಿಶಾಲಿ ಪ್ರಚೋದಕವಾಗಿದ್ದು, ಇದು ಬ್ಯಾಕ್ಟೀರಿಯಾದಿಂದ ಚಯಾಪಚಯಗೊಳ್ಳುವುದಿಲ್ಲ ಮತ್ತು ಬಹಳ ಸ್ಥಿರವಾಗಿರುತ್ತದೆ, ಆದ್ದರಿಂದ ಇದನ್ನು ಪ್ರಯೋಗಾಲಯಗಳಲ್ಲಿ ವ್ಯಾಪಕವಾಗಿ ಬಳಸಲಾಗುತ್ತದೆ.
ಐಪಿಟಿಜಿಯ ಅತ್ಯುತ್ತಮ ಸಾಂದ್ರತೆಯನ್ನು ಹೇಗೆ ನಿರ್ಧರಿಸುವುದು? ಉದಾಹರಣೆಯಾಗಿ ಇ. ಕೋಲಿಯನ್ನು ತೆಗೆದುಕೊಳ್ಳಿ.
ಧನಾತ್ಮಕ ಮರುಸಂಯೋಜಿತ pGEX (CGRP/msCT) ಹೊಂದಿರುವ E. coli BL21 ತಳೀಯವಾಗಿ ಮಾರ್ಪಡಿಸಿದ ತಳಿಯನ್ನು 50μg·mL-1 Amp ಹೊಂದಿರುವ LB ದ್ರವ ಮಾಧ್ಯಮಕ್ಕೆ ಚುಚ್ಚುಮದ್ದು ಮಾಡಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ರಾತ್ರಿಯಿಡೀ 37°C ನಲ್ಲಿ ಕಲ್ಚರ್ ಮಾಡಲಾಯಿತು. ಮೇಲಿನ ಕಲ್ಚರ್ ಅನ್ನು ವಿಸ್ತರಣಾ ಕಲ್ಚರ್ಗಾಗಿ 1:100 ಅನುಪಾತದಲ್ಲಿ 50μg·mL-1 Amp ಹೊಂದಿರುವ 50mL ತಾಜಾ LB ದ್ರವ ಮಾಧ್ಯಮದ 10 ಬಾಟಲಿಗಳಲ್ಲಿ ಚುಚ್ಚುಮದ್ದು ಮಾಡಲಾಯಿತು ಮತ್ತು OD600 ಮೌಲ್ಯವು 0.6~0.8 ಆಗಿದ್ದಾಗ, ಅಂತಿಮ ಸಾಂದ್ರತೆಗೆ IPTG ಅನ್ನು ಸೇರಿಸಲಾಯಿತು. ಇದು 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0mmol·L-1 ಆಗಿದೆ. ಅದೇ ತಾಪಮಾನದಲ್ಲಿ ಮತ್ತು ಅದೇ ಸಮಯದಲ್ಲಿ ಇಂಡಕ್ಷನ್ ಮಾಡಿದ ನಂತರ, ಅದರಿಂದ 1 ಮಿಲಿ ಬ್ಯಾಕ್ಟೀರಿಯಾದ ದ್ರಾವಣವನ್ನು ತೆಗೆದುಕೊಳ್ಳಲಾಯಿತು, ಮತ್ತು ಬ್ಯಾಕ್ಟೀರಿಯಾದ ಕೋಶಗಳನ್ನು ಸೆಂಟ್ರಿಫ್ಯೂಗೇಶನ್ ಮೂಲಕ ಸಂಗ್ರಹಿಸಿ SDS-PAGE ಗೆ ಒಳಪಡಿಸಲಾಯಿತು, ಪ್ರೋಟೀನ್ ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿಯ ಮೇಲೆ ವಿಭಿನ್ನ IPTG ಸಾಂದ್ರತೆಗಳ ಪ್ರಭಾವವನ್ನು ವಿಶ್ಲೇಷಿಸಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ನಂತರ ಅತಿದೊಡ್ಡ ಪ್ರೋಟೀನ್ ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿಯೊಂದಿಗೆ IPTG ಸಾಂದ್ರತೆಯನ್ನು ಆಯ್ಕೆ ಮಾಡಲಾಯಿತು.
ಪ್ರಯೋಗಗಳ ನಂತರ, ಐಪಿಟಿಜಿಯ ಸಾಂದ್ರತೆಯು ಸಾಧ್ಯವಾದಷ್ಟು ದೊಡ್ಡದಾಗಿಲ್ಲ ಎಂದು ಕಂಡುಬರುತ್ತದೆ. ಏಕೆಂದರೆ ಐಪಿಟಿಜಿ ಬ್ಯಾಕ್ಟೀರಿಯಾಕ್ಕೆ ಒಂದು ನಿರ್ದಿಷ್ಟ ವಿಷತ್ವವನ್ನು ಹೊಂದಿದೆ. ಸಾಂದ್ರತೆಯನ್ನು ಮೀರಿದರೆ ಕೋಶವೂ ಸಾಯುತ್ತದೆ; ಮತ್ತು ಸಾಮಾನ್ಯವಾಗಿ ಹೇಳುವುದಾದರೆ, ಜೀವಕೋಶದಲ್ಲಿ ಹೆಚ್ಚು ಕರಗುವ ಪ್ರೋಟೀನ್ ವ್ಯಕ್ತವಾಗುತ್ತದೆ, ಉತ್ತಮವಾಗಿರುತ್ತದೆ ಎಂದು ನಾವು ಭಾವಿಸುತ್ತೇವೆ, ಆದರೆ ಅನೇಕ ಸಂದರ್ಭಗಳಲ್ಲಿ ಐಪಿಟಿಜಿಯ ಸಾಂದ್ರತೆಯು ತುಂಬಾ ಹೆಚ್ಚಾದಾಗ, ಹೆಚ್ಚಿನ ಪ್ರಮಾಣದ ಸೇರ್ಪಡೆ ರೂಪುಗೊಳ್ಳುತ್ತದೆ. ದೇಹ, ಆದರೆ ಕರಗುವ ಪ್ರೋಟೀನ್ನ ಪ್ರಮಾಣ ಕಡಿಮೆಯಾಗುತ್ತದೆ. ಆದ್ದರಿಂದ, ಹೆಚ್ಚು ಸೂಕ್ತವಾದ ಐಪಿಟಿಜಿ ಸಾಂದ್ರತೆಯು ಹೆಚ್ಚಾಗಿ ದೊಡ್ಡದಾಗಿರುವುದಿಲ್ಲ, ಆದರೆ ಕಡಿಮೆ ಸಾಂದ್ರತೆಯಿರುತ್ತದೆ.
ತಳೀಯವಾಗಿ ಮಾರ್ಪಡಿಸಿದ ತಳಿಗಳ ಪ್ರಚೋದನೆ ಮತ್ತು ಕೃಷಿಯ ಉದ್ದೇಶವು ಗುರಿ ಪ್ರೋಟೀನ್ನ ಇಳುವರಿಯನ್ನು ಹೆಚ್ಚಿಸುವುದು ಮತ್ತು ವೆಚ್ಚವನ್ನು ಕಡಿಮೆ ಮಾಡುವುದು. ಗುರಿ ಜೀನ್ನ ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿಯು ತಳಿಯ ಸ್ವಂತ ಅಂಶಗಳು ಮತ್ತು ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿ ಪ್ಲಾಸ್ಮಿಡ್ನಿಂದ ಮಾತ್ರವಲ್ಲದೆ, ಪ್ರಚೋದಕದ ಸಾಂದ್ರತೆ, ಪ್ರಚೋದಕ ತಾಪಮಾನ ಮತ್ತು ಪ್ರಚೋದಕ ಸಮಯದಂತಹ ಇತರ ಬಾಹ್ಯ ಪರಿಸ್ಥಿತಿಗಳಿಂದಲೂ ಪ್ರಭಾವಿತವಾಗಿರುತ್ತದೆ. ಆದ್ದರಿಂದ, ಸಾಮಾನ್ಯವಾಗಿ, ಅಜ್ಞಾತ ಪ್ರೋಟೀನ್ ಅನ್ನು ವ್ಯಕ್ತಪಡಿಸುವ ಮತ್ತು ಶುದ್ಧೀಕರಿಸುವ ಮೊದಲು, ಸೂಕ್ತವಾದ ಪರಿಸ್ಥಿತಿಗಳನ್ನು ಆಯ್ಕೆ ಮಾಡಲು ಮತ್ತು ಉತ್ತಮ ಪ್ರಾಯೋಗಿಕ ಫಲಿತಾಂಶಗಳನ್ನು ಪಡೆಯಲು ಪ್ರಚೋದಕ ಸಮಯ, ತಾಪಮಾನ ಮತ್ತು IPTG ಸಾಂದ್ರತೆಯನ್ನು ಅಧ್ಯಯನ ಮಾಡುವುದು ಉತ್ತಮ.
ಪೋಸ್ಟ್ ಸಮಯ: ಡಿಸೆಂಬರ್-31-2021